In den endemischen, das heißt betroffenen Ländern, gehört nur die klinische Diagnose der Lepra zur alltäglichen Praxis. Nichtsdestotrotz kann der Erreger der Lepra, Mycobacterium leprae bakteriologisch, histologisch und durch die 1984 eingeführte PCR (polymerase chain reaction) nachgewiesen werden. Mit dieser Methode ("Polymerase-Kettenreaktion") kann die Erbsubstanz DNA vervielfältigt werden.
Laut WHO gilt die Diagnose der Lepra in endemischen Ländern als gesichert, wenn mindestens eines drei Kardinalsymptome vorliegt: 1) Vorhandensein von Lepra-typischen Hautläsionen mit vermindeter Sensibilität; 2) Verdickter periphere Nerven; 3) Mikroskopischer Nachweis von sauerfesten Stäbchen.
Neben den rein klinischen diagnostischen Kriterien gilt die Mikroskopie als diagnostisches Standardverfahren. Bei der multibazillären Lepra demonstriert die Ziehl-Neelsen-Färbung in der Regel säurefeste Stäbchen in der durch Skarifikation (Ritzen, Schröpfen) gewonnenen Lymphe (skin slit smear) der Unterhaut oder des Sekrets der Nasenschleimhaut. Der Nachweis bei Tuberkuloider Lepra gelingt selten. Die PCR (polymerase chain reaction) ist sensitiver und kann theoretisch die DNS eines einzigen Erregers nachweisen. Ein negativer Befund schließt jedoch die Infektion mit Mycobacterium leprae nicht sicher aus. Gleiches gilt für die histologische Untersuchung von Haut- und Nervenbiopsien etwa mit der Färbung nach Fite-Faraco.
Bis dato wurden mehrere serologische Tests entwickelt. Während die serologischen Tests weiterhin in der Diagnosesicherung der manifesten Lepra noch keine signifikante Rolle spielen, weisen mehrere Publikationen daraufhin, dass sie evtl. bei der Diagnose leicht verlaufender Fälle eingesetzt werden könnten.
